核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒（ribonucleoprotein particle），主要由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯yi功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，所以核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。核糖體無膜結(jié)構(gòu)，主要由蛋白質(zhì)（40%）和RNA（60%）構(gòu)成。核糖體按沉降系數(shù)分為兩類，一類（70S）存在于細(xì)菌等原核生物中，另一類（80S）存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

RiboLace Mod. 1核糖體提取試劑盒是一款由Immaginabiotechnology公司基于嘌呤霉素（嘌呤霉素是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu),能夠同氨基酸結(jié)合,代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合）通過無抗體、無融合標(biāo)簽蛋白的Pull-Down技術(shù)來分離活性核糖體的試劑盒。

操作使用

實(shí)驗(yàn)流程圖

（1）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

另外需自備的材料

l 10% 脫氧膽酸鈉（DNase/RNase free water）

l cycloheximide

l RiboLock RNase抑制劑

l SUPERase•In™ RNA酶抑制劑

l 無RNA酶和DEPC水

l 酸酚-氯仿混合液

l Nanodrop ND-1000 UV-VIS分光光度計(jì)

l 糖原藍(lán)色染料

l 異丙醇

l 微型離心機(jī)和無RNA酶微量離心管（0.2 mL和1.5 mL）

l 旋轉(zhuǎn)器

l 用于1.5mL試管的磁力支架

a. 稀釋RiboLace smart probe：在RiboLace smart probe中加入316.5 μL B-Buffer，然后在冰上解凍。使用后，建議將混合物等分，并儲(chǔ)存于-80℃，避免兩次以上的反復(fù)凍融。

b. 在裂解緩沖液Lysis Buffer使用前添加以下成分：脫氧膽酸鈉（1 %終濃度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制劑。

（2）裂解

貼壁細(xì)胞裂解

a.裂解前，使用10 µg/mL的環(huán)己酰亞胺（CHX）在37℃下處理細(xì)胞5 min。我們建議使用70-80 %匯合的細(xì)胞。CHX處理可提高核糖體親和純化的效率，可選步驟。如果您使用的是人體或小鼠組織，請(qǐng)注意裂解緩沖液和W-緩沖液中都含有CHX（10 ng/mL）。

b.孵育后，將細(xì)胞置于冰上，并用含有CHX（20 µg/mL）的冷PBS快速洗滌。

c.用移液槍去除PBS

d.將加入了脫氧膽酸鈉（1 %終濃度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制劑的裂解液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行裂解，并用力刮擦（適當(dāng)?shù)臋C(jī)械刮擦對(duì)有效裂解很重要）。

e.在1.5 mL離心管中收集細(xì)胞裂解物，并在20000 g離心5 min。

f.將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，冰浴20 min。

g.使用Nanodrop分光光度計(jì)，取1 µL細(xì)胞裂解液，檢測(cè)細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置Nanoddrop的“核酸"功能）

懸浮細(xì)胞裂解

a.裂解前，使用10 µg/mL的環(huán)己酰亞胺（CHX）在37℃下處理細(xì)胞5 min。我們建議使用70-80 %匯合的細(xì)胞。CHX處理可提高核糖體親和純化的效率，可選步驟。如果您使用的是人體或小鼠組織，請(qǐng)注意裂解緩沖液和W-緩沖液中都含有CHX（10 ng/mL）。

b.收集細(xì)胞，在4℃下以950 g離心5 min，棄培養(yǎng)基，用含有CHX的冷PBS（20 µg/mL）快速洗滌細(xì)胞。

c.收集并在4℃下以950 g離心5 min。除去上清液，并用加入了脫氧膽酸鈉（1 %終濃度）、5 U/mL DNase I和200 U/mL RiboLock RNase抑制劑的裂解液將細(xì)胞重懸。

d.通過G26針（約10次）使細(xì)胞裂解而不產(chǎn)生氣泡。

e.20000 g離心5 min。

f.將上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，冰浴20 min。

g.使用Nanodrop分光光度計(jì)，取1 µL細(xì)胞裂解液，檢測(cè)細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置Nanoddrop的“核酸"功能）

組織裂解

a. 用研缽和研杵在液氮下將紙巾碾碎。回收粉末于1.5 mL試管中

b. 每10 mg組織加入800 µL 組織裂解液 (IMMAGINA cat. nr. #RL001-2)，請(qǐng)注意裂解緩沖液和W-緩沖液中都含有CHX（10 ng/mL）。

c. 20000 g離心2 min并收集上清液。

d. 再次以20000 g離心上清液5 min，并收集上清液，冰浴20 min。

e. 使用Nanodrop分光光度計(jì)，取1 µL細(xì)胞裂解液，檢測(cè)細(xì)胞裂解液在260 nm處的吸光度（設(shè)置Nanoddrop的“核酸"功能）

（3）磁珠處理

a. 從4°C下取出RiboLace磁珠，并將試管置于RT下至少30分鐘。

b. 將RiboLace磁珠管渦旋30秒以上。

c. 加入90 µL RiboLace磁珠至新的1.5 mL試管中。最終體積=90 µL x N（N=樣品數(shù)量），隨后置于磁力架上，去除上清液。

d. 取下試管，用等體積（90 µL x N）的OH緩沖液洗滌RiboLace磁珠5分鐘，然后棄掉上清液。

e. 向離心管中加入900 µL不含核酸酶的水洗滌磁珠。

f. 加入體積為（90 µL x N）的B-緩沖液洗滌珠子，3分鐘，共兩次。將試管放于磁力架上至少1分鐘，然后棄上清液。

g. 加入（30 µL x N）體積的稀釋的RiboLace smart probe，1400 RPM室溫孵育1 h，注意不要讓磁珠沉淀，在孵育期間，可以進(jìn)行核酸酶處理的步驟。

h. 另取2 µL 已稀釋的RiboLace smart probe保存于冰上，作為后續(xù)驗(yàn)證。

i. 孵育后，將試管放在磁力架上，留存3 µL上清液作為驗(yàn)證。

j. 向管中加入一定體積（3 µL x N）mPEG，在室溫下在振蕩器中混勻15 min。注意不要讓磁珠沉淀。

k. 將試管置于磁力架上2-3 min，棄上清液，加入500 µL不含核酸酶的水洗滌。

l. 加入500 µL W緩沖液清洗磁珠，兩次。

m. 加入200 µL的W緩沖液將RiboLace磁珠重新懸浮，并根據(jù)樣品的（N）個(gè)數(shù)將結(jié)合的磁珠等分。注意不要讓磁珠變干。

n. 結(jié)合效率的預(yù)估：將孵育后的上清液與未與磁珠孵育的RiboLace smart probe在270 nm（Nanodrop ND-1000）處的吸光度進(jìn)行比較，可以估計(jì)磁珠結(jié)合效率（預(yù)計(jì)吸光度降低約10-50%）。

（4）核酸酶處理

a. 將W緩沖液加入總體積為0.1-0.3 A. U（260nm）的裂解液，至最終體積為150 µL。

b. 加入0.3 µL Stabilizing Nux Solution (SS)，吸打混勻。

c. 取2 mL管，加入1.5 µL核酸酶（Nux），并加入98.5 µL W緩沖液（WB）。用移液槍吸打5次，使稀釋的Nux溶液充分混勻。

d. 加入稀釋的核酸酶（Nux）溶液于1.5 mL離心管中，25°C處理樣品45 min，核酸酶（Nux）溶液使用體積（µL）為A.U x 5。

e. 加入0.5 µLSUPERase•In™ RNA酶抑制劑，冰浴10 min。

（5）核糖體Pull-Down

僅在添加細(xì)胞裂解液之前，去除W緩沖液（步驟3.m中）

a. 向步驟3.m中處理過的磁珠中加入處理過的細(xì)胞裂解液并充分混合。

b. 4°C，慢速（3 rpm）孵育70分鐘。

c. 取出離心管，不要離心，置于冰浴的磁力架上，保持在冰上操作，分離磁珠。

注意不要將磁珠從磁力架上取下，也不要觸摸磁珠。

d. 500 µL W緩沖液小心清洗磁珠兩次。

e. 從磁力架上取下，并用200 µL W緩沖液將磁珠重懸。

f. 將磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移至新的不含核酸酶的1.5 mL離心管中。

（6）核糖體分離

a. 向磁珠懸浮液中加入20 µL 10%SDS和5 µL蛋白酶K，并在37°C水浴75 min。

b. 加入225 µL酸性苯酚、氯仿、異戊醇混合物。

c. 渦旋混勻，14000 g離心5 min。

d. 如果離心后沒有分離，可加入20 µL 2 M NaCl（DEPC水），再次離心。

e. 保留水相并將其轉(zhuǎn)移至新的瓶中。

f. 加入500 µL異丙醇和2 µL糖源藍(lán)色染料。

g. 混合并室溫孵育3 min，然后在-80°C下儲(chǔ)存：

至少2小時(shí)或過夜。

h. 4°C下離心（20000 g）30 min。

i. 加入5 µL無核酸酶水將RNA沉淀重懸。

j. 使用PAGExt試劑盒（Cat. No ##KGE002_12）進(jìn)行RPFs PAGE純化。

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常見問題

1. 在進(jìn)行RiboLace Pull-Down之前，需要用環(huán)己酰亞胺處理細(xì)胞嗎？

答：CHX（環(huán)己酰胺）存在于試劑盒中包含的裂解液（LB）以及W緩沖液（WB）中。RiboLace在使用或不使用環(huán)己酰亞胺的情況下都能很好地發(fā)揮作用。也就是說，細(xì)胞是否添加CHX處理取決于實(shí)驗(yàn)設(shè)置。一些客戶在起始密碼子周圍發(fā)現(xiàn)了由于CHX引起的P位點(diǎn)周期性偽影。相反，CHX可以使核糖體保護(hù)片段的長(zhǎng)度在28個(gè)核苷酸處向更均勻的峰值移動(dòng)。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，20 µg/mL的CHX略微改善了P位點(diǎn)沿編碼區(qū)的分辨率周期性。例如，從沒有進(jìn)行CHX處理的快速冷凍腦組織中獲得了良好的P位點(diǎn)周期性。如果您的樣品易流失核糖體，我們建議增加W緩沖液中的CHX濃度（目前為20 µg/mL，至40 µg/mL），并在每個(gè)W緩沖液中加入30 mL CHX儲(chǔ)備溶液（10 mg/mL）。

2. 應(yīng)該如何冷凍Ribolace實(shí)驗(yàn)的樣品？

答：對(duì)于使用CHX裂解細(xì)胞，我們建議在進(jìn)行RiboLace之前進(jìn)行細(xì)胞裂解，并將其保存在-80的溫度下，保存時(shí)間最多1-2個(gè)月。

對(duì)于不使用CHX裂解細(xì)胞，我們建議在進(jìn)行RiboLace之前，快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃下，最多1-2個(gè)月。

對(duì)于組織樣品，我們建議在進(jìn)行RiboLace之前，快速冷凍組織并將樣品儲(chǔ)存（-80℃）最多1-2個(gè)月。

3. 不能在一天內(nèi)完成所有的步驟。處理過的磁珠可以儲(chǔ)存并第二天繼續(xù)嗎？

答：是的，可以停止。我們建議將磁珠保持在含有RiboLace smart probe的溶液中，即在磁珠分離和加入mPEG之前。在室溫1400 rpm孵育1 h后，可以將磁珠在4℃下儲(chǔ)存過夜，不要冷凍。

4. RiboLace Mod. 1適用于哪些物種？

答：一般來說，RiboLace在真核細(xì)胞和組織上效果良好，截至目前，已在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、小鼠和昆蟲組織中得到驗(yàn)證。

5. 試劑盒到貨后有效期多久？

答：12個(gè)月

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