OncoImmunin公司簡(jiǎn)介

新技術(shù)開發(fā)的需求/理由：

后基因組學(xué)/蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)代對(duì)用于在生理相關(guān)環(huán)境中測(cè)量生物活性分子的穩(wěn)健，具有成本效益和高通量技術(shù)的需求不斷增長(zhǎng)。滿足此需求的有效方法是開發(fā)工具和策略，以將報(bào)告分子傳遞到活細(xì)胞和組織中。這不僅用于引入可以評(píng)估真實(shí)生理過(guò)程的試劑，還為開發(fā)有效的療法提供了新途徑。

回應(yīng)-OncoImmunin，Inc .：

OncoImmunin，Inc.由Akira Komoriya博士和Beverly Packard博士于1994年創(chuàng)立。該公司是馬里蘭大學(xué)技術(shù)進(jìn)步計(jì)劃的早期參與者，后來(lái)畢業(yè)于一家擁有先進(jìn)設(shè)施的成熟研發(fā)公司。目前，它位于馬里蘭州蓋瑟斯堡，該地區(qū)擁有中小型生物技術(shù)公司。迄今為止，OncoImmunin已獲得了多項(xiàng)具有新應(yīng)用的美國(guó)和專有技術(shù)以及正在審查的CIP和PCT。

OncoImmunin-基礎(chǔ)技術(shù)的成功之處：

首先，設(shè)計(jì)，合成，驗(yàn)證并申請(qǐng)了具有高細(xì)胞滲透性的探針，用于報(bào)告來(lái)自所有細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的蛋白酶活性。這些分子的*方面包括：（1）從蛋白酶切割位點(diǎn)的兩側(cè)并入氨基酸序列信息（多十個(gè)氨基酸殘基），從而不僅為生物學(xué)識(shí)別提供線性特異性，而且還提供三維特異性（2）跨完整細(xì)胞膜，可測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶活性細(xì)胞（3）明智地選擇一系列熒光團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)多重化；（4）缺乏探針細(xì)胞毒性，可以長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)觀察。這些特性使用于活細(xì)胞測(cè)定的多參數(shù)應(yīng)用得以開發(fā)，適用于高含量和高通量的候選藥物篩選，用于定義細(xì)胞過(guò)程的分子事件，例如細(xì)胞凋亡，自噬，炎癥，癌癥轉(zhuǎn)移和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（包括ADCC）。

開發(fā)有助于細(xì)胞和組織通透性的結(jié)構(gòu)元件，是OncoImmunin專有設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，該專有設(shè)計(jì)用于治療性輸送基于肽的蛋白酶抑制劑以及其他細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。另外，遞送部分可以適合于在溶液中表現(xiàn)出優(yōu)異的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)但不能進(jìn)入活細(xì)胞的小分子。 

近，OncoImmunin的專有設(shè)計(jì)已應(yīng)用于由DNA，RNA或任何核苷酸類似物組成的寡核苷酸領(lǐng)域。這種新穎的細(xì)胞內(nèi)遞送技術(shù)的顯著方面是：可以在無(wú)毒性的情況下將任何序列的寡核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，而無(wú)需病毒載體，脂質(zhì)，鹽，去污劑，納米顆粒或電刺激。這種方法有望特別適用于基因調(diào)控，其中由于遞送載體，例如siRNA和反義治療劑，人們希望對(duì)基因表達(dá)或細(xì)胞活力的影響極小或沒(méi)有影響。

生產(chǎn)線：

無(wú)論是從事基礎(chǔ)研究還是開發(fā)研究，OncoImmunin產(chǎn)品都在不斷擴(kuò)展，以響應(yīng)生物醫(yī)學(xué)界的需求。OncoImmunin的許多探針是OncoImmunin科學(xué)家與研究團(tuán)體之間相互作用的直接結(jié)果

OncoImmunin PhiPhiLux®-G1D2說(shuō)明書

PhiPhiLux-G1D2

底物組成和熒光特征：

每個(gè)底物分子由熒光團(tuán)（非熒光素！）均勻標(biāo)記的肽組成。裂解的底物具有以下激發(fā)和發(fā)射峰：<unk>_ex=505 nm 和 <unk>_em= 530 nm。（完整的熒光，i.e.、預(yù)裂解、熒光蛋白酶底物未*淬滅（見(jiàn)下文）。）蛋白酶識(shí)別序列為 DEVDG我在那里₁和 P₁殘留物在紅色和藍(lán)色分別。

組件：caspase 3底物試劑盒目錄號(hào) A304R1G-5 包括 4 個(gè)綠色-加蓋小瓶，每瓶至少含 940<unk>l底物和 1 瓶 60 mL 流式細(xì)胞儀稀釋緩沖液。caspase 3底物試劑盒目錄號(hào) A304R1G-8 包括 8 個(gè)綠色-加蓋小瓶，每瓶至少含 770<unk>l底物和 2 瓶 60 mL 流式細(xì)胞儀稀釋緩沖液。  事件底物每瓶在 RPMI 1640 培養(yǎng)基中的濃度為 10<unk>M  含 25 mM HEPES。整個(gè)未開封的試劑盒可在室溫或 4⁰C. 如有小瓶  是  打開，然后應(yīng)在-10 至-20 時(shí)恢復(fù)⁰C. 恢復(fù)和/或重新打開前，應(yīng)輕輕離心小瓶，以除去任何液體 瓶蓋。

可能需要的其他試劑：胎牛血清 (FCS)。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析

培養(yǎng)條件：

從您的方案中刪除涉及固定或透化的所有步驟。請(qǐng)勿修復(fù)底物-用于抗體或其他試劑標(biāo)記的暴露細(xì)胞。

• 使用選定的凋亡誘導(dǎo)試劑（凋亡素）和/或抑制劑處理靶細(xì)胞。每個(gè)樣本集中應(yīng)包括兩個(gè)對(duì)照樣本，一個(gè)有溶劑（有機(jī)助溶劑），一個(gè)沒(méi)有溶劑（有機(jī)助溶劑）。溶媒濃度不應(yīng)超過(guò) 0.3% (v/v)（以 0.1% 為佳）。（如 E 中所述，F(xiàn)ITC 峰值通道以及  應(yīng)確定含和不含溶劑的半胱天冬酶陰性細(xì)胞的可能散射變化，以避免錯(cuò)誤結(jié)論。）
• 處理后，將細(xì)胞等分至 1.5 至 2.0 mL 微量離心管中，離心，然后移除所有培養(yǎng)基以盡量減少后續(xù)底物稀釋。建議：（一）避免使用高速臺(tái)式離心機(jī)；使用類似于正常處理細(xì)胞的離心條件。（二）配備細(xì)吸頭的溫和負(fù)壓吸引，  例如，建議使用移液器吸頭。
• 向各離心細(xì)胞沉淀中加入 75<unk>l 10<unk>M底物溶液（如果 10%FCS 適當(dāng)，則加入 8<unk>l FCS）。每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在 50 萬(wàn)至 100 萬(wàn)之間（見(jiàn)下文 A 和 B）。將細(xì)胞懸液與底物通過(guò)移液。請(qǐng)勿渦旋試管，因?yàn)榈蛲黾?xì)胞可能“脆弱”.
• 在 37 ℃ 下孵育試管⁰C 30-60 min 后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。（見(jiàn)下文 C。）保存底物生理 pH 條件下：避免直接暴露于底物光照和 pH.

流式細(xì)胞儀樣品制備和測(cè)定：

• 加入 1 mL 流式細(xì)胞儀稀釋緩沖液洗滌細(xì)胞一次，離心，除去所有培養(yǎng)基和緩沖液。用指尖輕彈試管松開細(xì)胞團(tuán)塊，然后將松散團(tuán)塊重懸于 1 mL 新鮮稀釋緩沖液中. 請(qǐng)勿渦旋含有細(xì)胞的試管，而是使用移液器重懸細(xì)胞。凋亡細(xì)胞可以是脆弱的。（參見(jiàn)  以下。）所有樣本應(yīng)在 37 次試驗(yàn)結(jié)束后 60-90 min 內(nèi)進(jìn)行分析^oC 孵育。
• 推薦的流式細(xì)胞儀設(shè)置：用 488 nm 激光線激發(fā)，F(xiàn)ITC 通道檢測(cè)。在*年為對(duì)照細(xì)胞群（不存在凋亡原（如適用，使用溶劑））的細(xì)胞設(shè)置峰值通道。然后運(yùn)行凋亡素處理的細(xì)胞群。
• 通過(guò)上述程序收集數(shù)據(jù)后，可以刪除 PI 陽(yáng)性細(xì)胞，如果ca. 加入 10<unk>l 5-10<unk>g/ml 碘化丙啶 (PI) 溶液，并在流動(dòng)中重新運(yùn)行樣品c細(xì)胞計(jì)數(shù)器（PI 的終濃度ca. 200 ng/mL），帶有 FITC 的點(diǎn)圖vs. PE（見(jiàn) D）。再分析應(yīng)為加入 PI 后 5-15 min 內(nèi)。

有用提示和警告：

• 孵育期間的細(xì)胞密度底物每份樣品應(yīng)在 50 至 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞之間（盡管可分析較低濃度）。建議將直接從對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物中采集細(xì)胞的對(duì)照樣品納入試驗(yàn)中，以評(píng)估默認(rèn)細(xì)胞凋亡水平。
• 在某些情況下，可以使用底物濃度低于 9mM（加入 FCS 至終濃度 10%v/v 將降低底物濃度至 9mM (視上)). 然而，該試劑盒已被配制成用于流式細(xì)胞術(shù)，與底物濃度at 10 mM 在大多數(shù)條件下獲得宜性能。活細(xì)胞攝取底物在 20 至 30 min 之間達(dá)到接近大值，在 37⁰C 在大多數(shù)細(xì)胞類型中。然而，作為底物攝取可能隨細(xì)胞類型和特定條件而變化，應(yīng)優(yōu)化孵育時(shí)間。

• 活細(xì)胞攝取底物在 20 至 30 min 之間達(dá)到接近大值，在 37⁰C 在大多數(shù)細(xì)胞類型中。然而，作為底物攝取可能隨細(xì)胞類型和特定條件而變化，孵育時(shí)間應(yīng)為 優(yōu)化
• 建議為了鑒別 PI 陰性凋亡和未誘導(dǎo)的細(xì)胞群，應(yīng)首先在不存在 PI 的情況下進(jìn)行分析，然后在加入 PI 后進(jìn)行第二輪數(shù)據(jù)采集。樣本  所有樣本的稀釋體積應(yīng)相同。點(diǎn)圖之間的比較 (FITC)vs. PE）的這兩組樣本將能夠輕松識(shí)別 PI 陰性細(xì)胞群，因?yàn)樵趦山M點(diǎn)圖中，這些細(xì)胞保持在 PE 軸上的相同位置。因此，如果將門控放置在 PI 陰性細(xì)胞周圍，然后將該門控內(nèi)的細(xì)胞繪制在 FL1 直方圖中，則該方法將導(dǎo)致對(duì)未誘導(dǎo)和凋亡的 PI 陰性細(xì)胞進(jìn)行分析。
• 如果一群熒光強(qiáng)度很低的細(xì)胞，i.e出現(xiàn)低于未誘導(dǎo)細(xì)胞群的情況，則很可能 (i) 樣品過(guò)度誘導(dǎo)和/或 (ii) 終溶劑濃度導(dǎo)致毒性。因此，應(yīng)納入溶劑對(duì)照樣本。

為了在直方圖中看到亮的凋亡細(xì)胞群，細(xì)胞必須保持其膜的完整性。請(qǐng)注意：所有 OncoImmunin 的原理底物工作是完整的底物擴(kuò)散穿過(guò)所有膜，i.e., 血漿以及細(xì)胞膜，通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散；一旦底物已被其同源蛋白酶識(shí)別和裂解，裂解的片段大部分保留在蛋白酶所在的膜側(cè)。因此，裂解底物片段在 PI 陰性細(xì)胞中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，一旦細(xì)胞失去其膜完整性（如 PI 陽(yáng)性所示），裂解的片段可能擴(kuò)散出細(xì)胞。由于完整底物的熒光未被*淬滅，加載底物的未誘導(dǎo)細(xì)胞群的熒光高于未暴露于底物的細(xì)胞群。因此，如果在過(guò)度誘導(dǎo)或暴露于高濃度有機(jī)助溶劑的情況下，膜完整的活細(xì)胞的通透性屏障喪失，那么完整以及裂解的碎片可能從誘導(dǎo)細(xì)胞中丟失。

在某些情況下，分析尚未發(fā)生半胱天冬酶活化的早期時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)觀察峰值通道數(shù)量的減少，觀察供試化合物本身是否誘導(dǎo)膜滲透性變化可能是有益的。一般而言，PI 陽(yáng)性或 TUNEL 檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞百分比較高的樣本中的細(xì)胞將處于晚期凋亡和/或壞死。PhiPhiLux 的使用^®-G₁D₂對(duì)于含有低百分比 PI 陽(yáng)性細(xì)胞的樣本是宜的。

在大多數(shù)情況下，建議降低凋亡素濃度，而不是簡(jiǎn)單地尋找更早的時(shí)間點(diǎn)。  PhiPhiLux 分析的適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)^®-G₁D₂-陽(yáng)性細(xì)胞應(yīng)如此大百分比  存在 PI 陰性細(xì)胞：理想情況下，樣本應(yīng)包含兩者未誘導(dǎo)和半胱天冬酶⁺/PI^-細(xì)胞。  條件  應(yīng)避免僅觀察到單一人群。在熒光顯微鏡下檢查細(xì)胞可能有助于確定確切的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo) 條件。

樣品數(shù)據(jù)：

PhiPhiLux-G1D2   熒光顯微鏡分析

培養(yǎng)條件：

從您的方案中刪除涉及固定或透化的所有步驟。請(qǐng)勿修復(fù)底物-用于抗體或其他試劑標(biāo)記的暴露細(xì)胞。

在大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物中，少數(shù)細(xì)胞默認(rèn)為死亡；應(yīng)將其用作陽(yáng)性對(duì)照。在無(wú)默認(rèn)死亡的罕見(jiàn)情況下，推薦使用已確定的凋亡素治療，例如 1<unk>M Staurosporine，以產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。

用于標(biāo)準(zhǔn)（非共聚焦）熒光顯微鏡

• 用選擇的凋亡誘導(dǎo)試劑和/或抑制劑處理靶細(xì)胞。每個(gè)樣本集中應(yīng)包括兩個(gè)對(duì)照樣本，一個(gè)有溶劑（有機(jī)助溶劑），一個(gè)沒(méi)有溶劑（有機(jī)助溶劑）。溶媒濃度不應(yīng)超過(guò) 0.3% (v/v)（以 0.1% 為佳）。（如上所述，對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，應(yīng)確定含和不含溶劑的半胱天冬酶陰性細(xì)胞的可能變化，以避免錯(cuò)誤結(jié)論。）
• (a) 對(duì)于懸浮細(xì)胞，向每個(gè)離心的細(xì)胞沉淀中，加入 75ml of 10 mM 底物溶液（加入 8ml of FCS，如果 10%FCS 合適）。每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)在 50 萬(wàn)至 100 萬(wàn)之間（見(jiàn)上文 A 和 B）。用指尖輕彈試管，混合含細(xì)胞和底物的混懸液. 請(qǐng)勿渦旋含有細(xì)胞的試管，因?yàn)榈蛲黾?xì)胞可能  “脆弱”.

(b) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，加入足夠的底物溶液，使單層細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞*覆蓋。與混懸液相同  細(xì)胞，在加入前一定要去除所有培養(yǎng)基底物-含溶液，以盡量減少稀釋底物。（對(duì)于貼壁細(xì)胞，建議培養(yǎng)皿底部附有玻璃蓋玻片。（聯(lián)系 OncoImmunin,Inc.針對(duì)  此類細(xì)胞培養(yǎng)皿的來(lái)源。）

3. 在試管或培養(yǎng)皿中以 37 ℃ 孵育細(xì)胞樣本^oC 30～60 min。確切的孵育時(shí)間為細(xì)胞  類型和誘導(dǎo)劑  特定。保存底物生理 pH 條件下：避免直接光照至底物以及暴露于 pH.

4. 用 PhiPhiLux 孵育后即刻®-G₁D₂ 底物 溶液：

• 對(duì)于懸浮細(xì)胞，用 1 mL 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)緩沖液或任何生理緩沖液（如 PBS）稀釋，離心，并用 1 mL 新鮮緩沖液替換上清液。根據(jù)熒光顯微鏡的燈功率和檢測(cè)能力，重復(fù)細(xì)胞清洗（通常再清洗 1-2 次）。每次洗滌后在熒光顯微鏡下檢查細(xì)胞，觀察是否  背景熒光足夠暗，可區(qū)分未處理對(duì)照細(xì)胞和處理細(xì)胞。

(b) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，移除 PhiPhiLux®-G₁D₂ 底物 溶液 和 清洗 溫和地 與 緩沖液。 執(zhí)行 a 相似 編號(hào) of 細(xì)胞

懸浮細(xì)胞樣本推薦的清洗循環(huán)。每次循環(huán)后，在熒光顯微鏡下觀察背景熒光水平。清洗貼壁細(xì)胞時(shí)應(yīng)特別小心，因?yàn)榕c非凋亡細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞通常更容易從平板上分離。因此，建議保存所有洗滌液，直至可識(shí)別陽(yáng)性細(xì)胞。

5. 推薦的顯微鏡設(shè)置為熒光濾光片。

用于共聚焦顯微鏡

由于共焦儀器中存在針孔及其光學(xué)過(guò)濾效應(yīng)，可刪除清洗步驟。因此，人們可以  具有底物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在或在給定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的任何時(shí)間添加底物。

事件底物適用于此類型實(shí)驗(yàn)的濃度應(yīng)小于貯備液濃度 10mM. 建議一系列的底物稀釋范圍從 5 到 1mM 執(zhí)行。

當(dāng)使用共聚焦顯微鏡時(shí)，必須設(shè)置適當(dāng)?shù)奶綔y(cè)器增益和激光功率設(shè)置。一般在任何細(xì)胞培養(yǎng)中，都有少量的凋亡細(xì)胞，i.e. 默認(rèn)死亡的細(xì)胞。后者與健康對(duì)照細(xì)胞結(jié)合使用可作為設(shè)置動(dòng)態(tài)范圍的限制。一個(gè)很好的起點(diǎn)是使用默認(rèn)死亡細(xì)胞的信號(hào)作為大值的 90%，健康細(xì)胞作為陰性或較低的信號(hào)水平。

注意：在多個(gè)底物濃度，與胞外域的像素強(qiáng)度相比，健康細(xì)胞胞內(nèi)域的像素信號(hào)強(qiáng)度通常較低。這是由于完整細(xì)胞的膜通透性屏障。  當(dāng)給定的半胱天冬酶活性被激活后，同源蛋白酶裂解底物，由于細(xì)胞的去猝滅，細(xì)胞內(nèi)像素強(qiáng)度水平將高于細(xì)胞外強(qiáng)度底物。如果  細(xì)胞質(zhì)面積僅達(dá)到細(xì)胞外水平，因此在該時(shí)間點(diǎn)不能明確聲明該熒光強(qiáng)度增加僅由半胱天冬酶活性引起，因?yàn)閮H給定細(xì)胞的膜滲透性增加可解釋該增加。然而，強(qiáng)度增加高于背景相關(guān)強(qiáng)度底物只有當(dāng)熒光團(tuán)與底物通過(guò)靶半胱天冬酶對(duì)完整細(xì)胞的作用去淬滅底物通過(guò)切割底物分成兩個(gè)片段。

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