LenioBio GmbH是一家專注于蛋白質(zhì)表達(dá)解決方案的生物技術(shù)公司。LenioBio總部位于德國(guó)杜塞爾多夫，由商業(yè)資深人士和蛋白質(zhì)表達(dá)專家于2016年成立。2018年三月，LenioBio簽署了陶氏益農(nóng)的許可協(xié)議，以推出自己專有的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)下LenioBio品牌愛麗絲^®。LenioBio目前正在進(jìn)一步開發(fā)該技術(shù)，通過(guò)智能設(shè)計(jì)進(jìn)行創(chuàng)新，以利用自然的力量來(lái)加速合成生物學(xué)。歷史和背后的愛麗絲技術(shù)的特點(diǎn)^®在技術(shù)部分描述。

在LenioBio，我們所做的一切都始于我們的使命：為客戶提供創(chuàng)新的解決方案，以的輕松，快速和的方式應(yīng)對(duì)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。這種深切的承諾是我們的名字Lenio的核心，它源自拉丁語(yǔ)“緩解，減輕，改善”。

LenioBio –應(yīng)用性更好的科學(xué)。

leniobio AL0103500說(shuō)明書

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描述

“愛麗絲^®是一個(gè)*的真核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，可以生成一個(gè)的3毫克/毫升在批處理模式的蛋白質(zhì)，與市場(chǎng)上的其它真核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，它僅產(chǎn)生0.1毫克/毫升或更小進(jìn)行比較。即使是通常只能處理易于表達(dá)的蛋白質(zhì)的原核無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，也只能以批處理方式產(chǎn)生1 mg / mL的蛋白質(zhì)。”

技術(shù)指標(biāo)

規(guī)格信息

套件組件

來(lái)源于植物細(xì)胞的細(xì)胞裂解液

保質(zhì)期

12個(gè)月

貯存溫度

-70°C至-80°C

活動(dòng)驗(yàn)證

至少3毫克的表達(dá)/以下愛麗絲的手動(dòng)時(shí)毫升增強(qiáng)黃色熒光蛋白的^®

用戶提供的設(shè)備和材料：

手套

•吸管過(guò)濾頭（無(wú)核糖核酸酶）

•無(wú)核糖核酸酶的水（例如來(lái)自微孔過(guò)濾裝置的水）

•軌道振動(dòng)篩

o當(dāng)在試管中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)：

桌面搖床（2毫升容器插入物），搖床直徑：3毫米或0，當(dāng)在平板中進(jìn)行反應(yīng)時(shí)：

濕度控制（高達(dá)80%）的振動(dòng)篩，振動(dòng)直徑：25 mm，帶固定板和96個(gè)半孔板（無(wú)RNase）

運(yùn)輸和儲(chǔ)存

Alice®套件采用干冰運(yùn)輸。到達(dá)后，立即按上表所示存放部件。在這些條件下，反應(yīng)混合物至少穩(wěn)定12個(gè)月。

產(chǎn)品使用限制

這個(gè)工具包僅供研究之用。不得用于疾病的診斷、預(yù)防或治療，也不得用于人類。請(qǐng)參閱我們網(wǎng)站上的有限使用標(biāo)簽許可證（LULL）：

產(chǎn)品保修

工具包是用干冰冷凍運(yùn)輸?shù)?。如果交貨時(shí)包裝內(nèi)沒(méi)有干冰，或者包裝損壞，則可能會(huì)影響套件的質(zhì)量。如果交貨有任何問(wèn)題，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。保修有效期至產(chǎn)品標(biāo)簽上注明的到期日。

質(zhì)量管理

高質(zhì)量的化學(xué)品和材料已被用于制造該套件的組件。每批產(chǎn)品都經(jīng)過(guò)仔細(xì)的測(cè)試，以確保所有部件都符合規(guī)定的規(guī)格（見分析證書）。

安全

使用者應(yīng)遵守處理化學(xué)品和重組DNA的所有適用法規(guī)。處理套件組件時(shí)，應(yīng)穿戴實(shí)驗(yàn)室工作服、安全眼鏡和手套。處理超冷材料時(shí)，請(qǐng)戴上額外的防護(hù)手套，以免凍傷。使用過(guò)的部件應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行處理。

免責(zé)聲明

對(duì)于因使用、誤用或因使用本工具包而造成的任何直接或間接損害或損失，我們不承擔(dān)任何責(zé)任。

介紹

從粗細(xì)胞提取液中提取的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)（cfpe）系統(tǒng)作為一種研究工具已經(jīng)應(yīng)用了幾十年，并在蛋白表達(dá)技術(shù)中引入了許多誘人的優(yōu)勢(shì)。

然而，采用cfpe系統(tǒng)替代細(xì)胞法的一個(gè)關(guān)鍵障礙是蛋白質(zhì)產(chǎn)量相對(duì)較低的問(wèn)題。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，Leniobio利用植物細(xì)胞生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)，引入了一種新的真核細(xì)胞自由表達(dá)系統(tǒng)：Alice。Alice®在批處理模式下提供的高達(dá)3毫克/毫升的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。因此，它能讓你克服活體宿主系統(tǒng)的限制，在數(shù)小時(shí)內(nèi)而不是數(shù)周內(nèi)獲得“難以產(chǎn)生”的蛋白質(zhì)。系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)

其中包括：

•高產(chǎn)：高達(dá)3 mg/ml的表達(dá)蛋白

•易于使用：一步反應(yīng)方案

•快速：僅需48小時(shí)即可獲得高產(chǎn)量

靈活：表示“難以生產(chǎn)”蛋白質(zhì)、細(xì)胞毒性蛋白等。愛麗絲®利用煙草細(xì)胞裂解物，耗盡空泡。該系統(tǒng)包含體外轉(zhuǎn)錄所需的所有因子（rna聚合酶，ntps）和翻譯反應(yīng)（核糖體，翻譯起始/延伸因子，trna等）。使用一個(gè)簡(jiǎn)單的協(xié)議，rna轉(zhuǎn)錄和翻譯都發(fā)生在一個(gè)單管（耦合轉(zhuǎn)錄/翻譯）。

反應(yīng)是通過(guò)簡(jiǎn)單地混合質(zhì)粒DNA與愛麗絲®反應(yīng)混合物開始的。Alice®的蛋白質(zhì)產(chǎn)量基于反應(yīng)期間的蛋白質(zhì)表達(dá)。因此，我們建議反應(yīng)持續(xù)時(shí)間為48小時(shí)。Alice®提供了兩種表達(dá)載體，即PALICE01和PALICE02，它們是根據(jù)感興趣蛋白質(zhì)的靶向性而使用的（見第5頁(yè)）。當(dāng)與Alice®表達(dá)系統(tǒng)一起使用時(shí)，它們被特別定制以提供的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。PALICE01用于在ALICE®胞質(zhì)部分中的表達(dá)。以palice02為靶向微粒體提供了通過(guò)翻譯后修飾如二硫鍵來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)。

除篩選外，alice®系統(tǒng)還可用于大規(guī)模表達(dá)靶蛋白。

Alice®系統(tǒng)的潛在附加應(yīng)用包括：

•目標(biāo)蛋白特性

•蛋白質(zhì)優(yōu)化

•突變篩選

•蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

•表達(dá)分析

•蛋白質(zhì)定位分析

•蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

•翻譯后修飾分析

•代謝組學(xué)

•除草劑篩選

Alice®表達(dá)式向量

Alice®提供了兩個(gè)不同的表達(dá)式向量：palice01和palice02。palice01作為細(xì)胞溶質(zhì)表達(dá)載體，而palice02使用信號(hào)肽作為微粒體靶向。

微粒體是在Alice®反應(yīng)混合物的制造過(guò)程中，由部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成的類似細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)。利用蜂毒素信號(hào)肽，蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)運(yùn)到這些細(xì)胞器中（Buntru等人，2014），在那里進(jìn)行翻譯后修飾。隨后，微粒體可以被破壞以恢復(fù)表達(dá)的蛋白質(zhì)（見第9頁(yè)）。palice01和palice02也可以作為表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照，分別在細(xì)胞溶膠和微粒體中加入alice®反應(yīng)混合物時(shí)表達(dá)eyfp。

克隆成柵欄載體制備模板

下面提供了包含PALICE01和PALICE02載體特征的地圖（圖1），以及感興趣基因5'和3'方向克隆側(cè)的擴(kuò)展視圖（圖2和圖3）。

克隆位點(diǎn)允許在t7啟動(dòng)子和5'未翻譯區(qū)后面插入感興趣的基因?？寺∧愀信d趣的基因既可以從現(xiàn)有的載體中分離出來(lái)，也可以通過(guò)PCR擴(kuò)增其編碼區(qū)域來(lái)引入適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)。

細(xì)胞溶質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒palice01的推薦限制位點(diǎn)為ncoⅠ和kpn i，而微粒體表達(dá)質(zhì)粒推薦限制位點(diǎn)為ncoⅠ/noti或ncoⅠ/kpni。如果使用kpn i進(jìn)行克隆，請(qǐng)確保打開的閱讀框包含一個(gè)停止密碼子。

dna的純化

為了促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)，需要高純度的質(zhì)粒dna制備。因此，強(qiáng)烈建議使用基于陰離子交換色譜法的質(zhì)粒制備程序（例如Macherey Nagel的Nucleobond®Xtra Midi）。對(duì)于基于二氧化硅基質(zhì)的質(zhì)粒dna制備試劑盒，我們建議在轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)之前添加rnase抑制劑或苯酚氯方純化模板。根據(jù)插入物的大小，通過(guò)添加適當(dāng)體積的5 mm Tris緩沖液（pH8.5），將終質(zhì)粒DNA調(diào)整到所需濃度。反應(yīng)混合物中的終濃度應(yīng)為5nm。在-20℃下分批儲(chǔ)存。耦合轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)設(shè)置耦合轉(zhuǎn)錄-翻譯反應(yīng)的典型反應(yīng)體積為50微升。

1）選擇反應(yīng)容器：

•Alice®試管=每次反應(yīng)52微升

•96個(gè)半孔板，每個(gè)反應(yīng)的Lid1=50微升

2）準(zhǔn)備DNA

從倉(cāng)庫(kù)中取出質(zhì)粒dna模板，并在室溫（20-25°C）下解凍。輕輕攪拌，翻轉(zhuǎn)并快速向下旋轉(zhuǎn)，收集試管底部的內(nèi)容物，然后放在冰上。稀釋或濃縮質(zhì)粒，組裝反應(yīng)的終濃度應(yīng)為5nm。dna濃度對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量有顯著影響。

3）解凍Alice®反應(yīng)混合物

從倉(cāng)庫(kù)中取出Alice®反應(yīng)混合物，并在室溫（20-25°C）水浴中解凍。通過(guò)倒置試管輕輕混合。不要旋渦！解凍后直接放在冰上。解凍后30分鐘內(nèi)開始反應(yīng)。將剩余的裂解液直接冷凍在-80°C。不要使用液氮！避免一次以上的凍融循環(huán)！